イントロダクション／背景

イントロダクション

マイセトーマ(mycetoma)は顧みられない熱帯病(neglected tropical disease)の１つで、皮下組織で発生する、大きい腫瘍状の傷病を特徴とした疾患である。マイセトーマは70種以上の異なる病原体に起因するが、世界中の全ての発生例の内79.5%をその中の4種類が占める。適切な医療処置は、原因生物を適切に識別することによりもたらされる。現在のマイセトーマの診断法は、時間がかかり、侵襲的で、感度や特異性が低く、高価である。現在のところ、マイセトーマをポイント・オブ・ケアで診断できる検査方法は存在しない。

プロジェクトの目的

マイセトーマ患者の尿と血漿における、4種類の主たる原因生物に特異的なマーカーを発見すること。

プロジェクト・デザイン

原因生物特異的なマーカーを発見するために、次の5段階のアプローチを行う。

1.   マイセトーマ患者から、尿と血漿を採取する。

2.   PCRにより、原因生物を識別する。

3.   エクソソームには原因生物特異的なマーカーが含まれている可能性が高いため、尿と血漿からエクソゾームを単離する。

4.   エクソゾームからRNAを抽出し、シーケンス(塩基配列解析)する。

5.   遺伝子発現プロファイルを取得し、マーカーを同定する。

MycEXomicsで同定するマーカーは、後日、マイセトーマの初期症状例を検知するためのポイント・オブ・ケアの診断ツールを開発するために用いられる。

本プロジェクトによって、グローバルヘルスの課題はどのように解決されますか？

マイセトーマは衰弱させる疾患で、多数の患者が親族や社会に依存することになる。マイセトーマの治療は高額で長期間に及ぶ。そのうえ、真菌由来のマイセトーマの場合は手術だけでなく切断も必要となる。よりよい治療を成功できるのは、マイセトーマを初期に診断できた時である。現在は、マイセトーマをポイント・オブ・ケアで検査する方法はなく、初期(亜臨床的)症例をスクリーニングすることは不可能である。結果的に、当該疾患は後期段階のみに発見されることが多い。将来のポイント・オブ・ケアの診断ツール開発に使えるマーカーを同定することにより、マイセトーマをできる限り早期に発見し、切断除去を不要とすることを目指す。

本プロジェクトが革新的である点は何ですか？

現在はマイセトーマを診断するためのマーカーは存在しないため、尿や血漿から直接このようなマーカーを発見することができれば我々が最初となる。エクソゾームからRNAを抽出することにより、マイセトーマ患者に関連する(host-associatedな)マーカーばかりでなく、病原体に関連する(pathogen-associated な)マーカーを発見できる可能性を最大化できる。

各パートナーの役割と責任

理化学研究所

GHITによる研究費を管理し、エクソゾームから抽出したRNAをシーケンスし、マーカー候補遺伝子の発現プロファイルを取得する。

ハルツーム大学マイセトーマリサーチセンター（MRC）＆ Hospital General de México

Mycetoma Research Centre (MRC)とHospital General de Méxicoはマイセトーマ患者からの血液ならびに尿サンプルを取得する。また、各機関で定められたプロトコルにより患者を診断する。

エラスムス医療センター

Erasmus MC (EMC)はシーケンスによる原因生物を確認し、取得サンプルからエクソゾームの単離、RNAの抽出を行う。

最終報告書

1．プロジェクトの目的

種レベルの病原体同定や、患者への治療効果測定のため、尿や血漿内のエクソソームに存在する主なマイセトーマ病原体の特異的マーカー同定を目的とする。このマーカーを用いることでPOC診断法の開発につなげられ、未発症例の同定、大規模スクリーニング施策、早期発見による切断を伴わない早期治療が可能となる。

2．プロジェクト・デザイン

発見コホートのため、(1)被験者（患者および健常者）の募集、(2)尿および血漿サンプルの取得、(3)マイセトーマ腫瘍からの病原体の特定、(4)尿および血漿中のエクソソームを単利し、そこから抽出したRNAを用いたsmall RNAとmicro RNAの転写産物プロファイリング、(5)マーカー同定のための統計的解析、を行う。

3．プロジェクトの結果及び考察

MycEXomicsは Target Research Platform (TRP)として５項目実施した。１つめとして、発見コホートのため139名の被験者を募集した。２つめに病原体を特定するため、Eumycetoma病原体にはInternally Transcribed Spacer (ITS)バーコード遺伝子、Actinomycetomaにはhsp65バーコード遺伝子に対するシーケンシングを行い確認した。M. mycetomatisの遺伝的な多型同定のため, a Short-Tandem-Repeat Assay (MmySTR) を行いジェノタイピングを実施した。
３つめに発見コホートの血漿および尿資料からエクソソームを単利し、RNA抽出を行った。
４つめにRNAシーケンシングおよびmicroRNAシーケンシングによりエクソソームRNAのプロファイリングを行った。その際に読まれたRNA断片はヒトゲノムおよび病原体ゲノムの両方にマッピングした。最後に統計的解析で３種類の分子診断マーカーを同定した (病原体特異的マーカー、miRbase 22.1による宿主特異的マーカー、GENCODE 42による宿主特異的マーカー)。
今後マーカー遺伝子リストを用いてGene set enrichment analysis (GSEA)を行い、これらの遺伝子の背景にある生物学的な理解を解析する予定である。

[特記事項]

• プロジェクト期間のメキシコシティのパンデミックにより、本プロジェクトの共同研究者による発見コホートが実施できなかった。そのため、現在の発見コホートは地理的に１か所（スーダン）で募集したもののみである。
• マイセトーマ患者の尿および血漿中の細胞外小胞(extracellular vesicles, EV)中の病原体マーカーを同定するMycEXomicsアプローチの可能性を示すことができた。
• 我々の知る限り、NTDに対する本プロジェクトのアプローチは初めてであり、他のNTDでの診断や治療マーカーの探索にも適用できると考えられる。

結論として、MycEXomicsの本ステージにおいて、TRPの開発ならび実行は成功した。